32通道移液工作站在禽流感檢測血凝抑制實驗（HI實驗)中的應用

        方 案 摘 要    

禽流感病毒（AIV）屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類；乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。

在禽流感防控領域，血凝抑制實驗（HI實驗）作為血清學檢測的金標準，其檢測效率與準確性直接關系到疫情監(jiān)測和疫苗評價的質量。傳統手工操作面臨通量低、重復性差等瓶頸，32通道移液工作站含4個并排的8通道移液頭，是傳統的8道移液槍的4倍，通過高通量的自動化移液技術重塑實驗室工作流程，顯著提升HI實驗的標準化水平與檢測能力。

          方 案 詳 情      

   一.實驗原理          

 ?HI實驗又叫血凝抑制實驗。?是通過利用特異性抗體抑制血凝現象，從而檢測血清中的抗體滴度的一種方法。

二.實驗準備             

1、設備和材料

① fluidot 32道移液工作站FDT-8*4-16或FDT-8*4-28

② 96孔血凝板 ICF-PS-96V-S

③血凝/血凝抑制實驗分析儀

2、試劑和材料

① 阿氏(Alsevers)液。

② 21%(體積分數)雞紅細胞懸液。

③ pH 7.2、0.01 mol/L PBS。

④ AIV HA 分型參考抗原、參考陽性血清、陰性血清。

  三.實驗步驟          

1、工作站自動取32個吸頭，在 96孔V形微量反應板中，1-11列加25μL PBS，12列加50μL PBS

2、雞血清不需要處理，可直接進行檢測；若為水禽或奶牛等血清，建議將血清進行預處理。取32個吸頭，第1列加 25μL血清，自動吹吸混勻。

3、與PBS充分混勻后吸25μL于第2行；若血清經過預處理，第1列不加PBS，直接加處理過的血清25μL，第2列加入處理過的血清25μL，與 PBS充分混勻后吸25 μL于第3孔。依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL，棄去，第 11 孔作為抗原對照。單獨設立兩行對照，一行加陽性血清，一行加陰性血清。

4、取32個吸頭，第1列~第11列等量加入25μL 4HAU抗原，在室溫(約 20 ℃)下靜置 30 min或4 ℃ 60 min。

5、取32個吸頭，每孔加入25 μL, 1%(體積分數)雞紅細胞懸液，自動混勻后棄去吸頭，在室溫(約 20 ℃)下靜置 40 min 或4℃ 60 min，空白對照孔(12 孔)紅細胞呈顯著紐扣狀時判定結果。

   四、結果判定   

1、 當抗原/病毒對照孔(第 11孔)完全凝集，且陰性對照血清抗體效價不高于 1:4，陽性對照血清抗體效價與已知效價誤差不超過1個滴度時，試驗結果方可成立。以完全抑制4HAU 抗原/病毒的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI抗體效價。

2、 用于檢測抗原/病毒時，能夠被某亞型 AIV參考陽性血清特異性抑制，H抗體效價≥1:16時判定為該亞型 AIV 陽性；1:2≤H抗體效價<1:8判為該亞型 AIV 疑似，應結合其他病毒檢測方法進行鑒定；無HI抗體效價判為該亞型AI 陰性。

3、 用于檢測抗體/血清時，免疫禽 H抗體效價≤1:8判為陰性，HI抗體效價>1:16判為陽性。

 4、 若血清進行了預處理，當抗原/病毒對照孔(第 11孔)完全凝集，且陰性對照血清抗體效價<1:10，陽性對照血清抗體效價與已知效價誤差不超過1個滴度時，試驗結果方可成立。以完全抑制4hau抗原>1:20時判定為陽性;

血清抗體效價<1:10判為陰性；用于檢測免疫水禽抗體/血清時，血清H抗體效價<1:10判為陰性，血清hi抗體效價>1:10判為陽性；用于未免疫水禽或哺乳動物感染病毒診斷依據時，HI抗體效價≥1:20判為陽性。